Spektrofotometri
Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu teknik analisis spektroskopi yang menggunakan sinar radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan menggunakan instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak digunakan untuk analisis kuantitatif dibandingkan analisis kualitatif.
Spektrofotometer terdiri atas spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer merupakan alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorpsi. Spektrofotometer tersusun atas sumber spektrum yang tampak kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blanko, dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blanko ataupun pembandingnya1.
Dalam percobaan spektrofotometer UV-Vis, hukum yang mendasarinya yaitu hukum Lambert-Beer. Dalam menjabarkan hukum Lambert-Beer ini perlu diperhatikan adanya anggapan bahwa:
1. Radiasi yang masuk dalam kuvet adalah monokromatik
2. Penyerapan terjadi dalam volume yang mempunyai luas penampang yang sama
3. Dengan tenaga radiasi yang cepat (tidak terjadi fluoresensi)
4. Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi (tidak berlaku pada konsentrasi tinggi).
Dalam menganalisis suatu sampel menggunakan metode ini, berkas radiasi/cahaya dikenakan pada sampel dan intenstas radiasi yang ditransmisikan diukur. Sampel ditempatkan dalam sel atau kuvet yang terbuat dari gelas yang khusus. Radiasi yang diserap oleh sampel ditentukan dengan membandingkan intensitas dari berkas radiasi yang ditransmisikan (bila spesies penyerap tidak ada) dan dengan intensitas yang ditransmisikan (bila spesies penyerap ada). Kekuatan radiasi (intensitas radiasi/sinar) sebanding dengan jumlah foton per detik yang melalui satu satuan luas penampang kuvet/sel. Kekuatan radiasi akan turun bila terjadi penghamburan dan pantulan. Namun kedua hal tersebut sangat kecil kemungkinannya untuk terjadi dila dibandingkan dengan serapan2.
Spektrofotometer UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel yang berupa larutan, gas atau uap. Untuk sampel berupa larutan perlu diperhatikan pelarut yang dipakai, antara lain yaitu:
1. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur molekulnya dan tidak berwarna.
2. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis.
3. Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis.
Pada daerah ultraviolet pelarut yang biasa digunakan yaitu: aseton, benzen, karbon tetraklorida, kloroform, dioksan, diklorometan, etanol 95%, etil eter, metanol, air dan sebagainya. Pelarut yang digunakan dalam spektrofotometri harus melarutkan cuplikan dan meneruskan radiasi dalam panjang gelombang yang sedang dianalisa3.